使用z-position減少螢光雜訊

 

Q:測螢光，但雜訊太高怎麼辦?

A: Spark在做上方讀取螢光時，可自動執行Z-position針對特定的well找

到最佳螢光訊號或訊雜比(signal/noise ratio)之位置，並以圖表顯示掃描結

果。最佳讀取位置可應用在每次螢光讀取上,亦可作手動1μm調整自行決定

讀取位置。

 

z-position:測量頭(fiber)與微量盤表面的間距。在Tecan的Spark，是以μm為

調整單位。它的z-position不僅可作上方(top)，還能作下方(bottom)

自動偵測哦!

如何執行z-position?

1.選一個well(A1)加染劑(Signal來源),另一個well(A2)加緩衝液(Blank來源),按SCAN(下圖紅框),開

始作z-position

2. SCAN完會自動顯示下面紅框內數據:

Well 1 (Signal):染劑的螢光強度最佳之位置

Well 2 (Blank):緩衝液的螢光強度最佳之位置

Max S/B ratio:軟體自行計算Signal除以Blnak,顯示Max S/B ratio的位置。

Manual: default值是20000 μm (指探測頭到微量盤表面的距離為2cm)。依客戶手動調整(下面紅色

箭頭指的那隻手),作左右拉黃線,確定要讀取的位置後再按

 

Apply,之後的量測都會以manual的值作為z-position

Katy Yang

二向鏡Dichroic Mirror簡介

 在Tecan的Infinite 200 pro機型Fnano plus與F plex, 標配下面兩種濾鏡,來有效提高訊雜比，尤其是二向鏡有效減少Fluorescein與HTRF的訊號干擾。

(1) 50% Mirror(50%弱化濾鏡):讓發散光的光通量少一半的光學濾鏡

(2) 510 Dichroic(510二向鏡):可讓染劑激發光反射給樣品,同時讓發散光通過給EM濾鏡之光學濾鏡(圖一)

圖一: 機型Fnano plus與F plex的光學原理

其中Beamsplitter是二向鏡或弱化濾鏡

圖二: 機型Fnano plus與F plex的

標配濾鏡應用範圍

 　　執行操作軟體時,若Mirror選擇Automatic時,機器會依據「激發光(簡稱EX)」與「發散光(簡稱EM)」之設定波長,自動選擇510二向鏡或50%弱化濾鏡。若兩個EX與EM波長都在510二向鏡應用範圍(圖二),則儀器會自動使用510二向鏡,若其一種波長沒在此範圍,則改使用50%弱化濾鏡。

　　經二向鏡篩選後的EX和EM的訊號會比弱化濾鏡來的好,因此訊雜比也會來得較少。螢光偵測儀必須由燈泡給螢光樣品一個激發光，二向鏡能有效篩選掉偵測發散光時激發光所產生的雜訊。

　　若樣品使用螢光染劑Fluorescein,因為它的EX光譜與EM光譜有重疊部分(圖三),當執行螢光量測時,EM訊號產生時,重疊的部分會再次去被染劑吸收,造成訊號干擾

圖三(左):

螢光染劑Fluorescein的EX光譜與EM光譜

圖四: 螢光染劑Fluorescein的EX與EM最高峰

與建議應用濾鏡

用510二向鏡優點(使用圖四濾鏡說明):

使用EX濾鏡:485nm(20nm)

當光源通過EX濾鏡:485nm(20nm),即475-495nm的光通過-->通過510二向鏡,反射475-490nm的光(排除大於490nm的迷光)通過樣品

使用EM濾鏡:535nm(25nm)

樣品放出訊號(下圖約450-690nm)-->通過510二向鏡,讓515-690nm的光通過(排除小於510nm的迷光)-->通過EM濾鏡:535nm(25nm),即522.5-547.5nm的光通過-->進入detector

Katy Yang