Uno Single Cell Dispenser™ and Spark® Cyto multimode imaging
reader to accelerate cell line development.
引言：
單細胞株是單株細胞系開發中的關鍵步驟，應用範圍涵蓋治療蛋白生產、藥物篩選、基因治療以及探索細胞功能和疾病機制。確保細胞群體來源於單一細胞，對於避免產品品質和重組蛋白不穩定性的差異，提高實驗的重複性至關重要。細胞株的重要性在於它們能夠在不同實驗條件下為可靠和標準化的結果做出貢獻。
限數稀釋法(limiting
dilution)是一種常見的單細胞分選方法。它涉及將細胞稀釋至低濃度，以獲得每個孔基於泊松(Poisson)分佈的單一細胞。然而，有限稀釋固有地效率低下，大多數孔最終沒有細胞或有多於一個細胞。孤立單一細胞的最廣泛使用的方法是利用螢光活化細胞分選（FACS），但商業上可用的儀器復雜、昂貴，並可能影響細胞健康。
本技術筆記描述了
Uno 單一細胞分配器用於孤立單一細胞的方法。該儀器利用微流體數字式分配技術，溫和地分離可行細胞，適用於各種下游應用，包括細胞系開發。通過添加能夠與細胞DNA結合的螢光染料，評估了
Uno 分配後的單一細胞的存活性，使用了
Spark Cyto 的全孔域螢光成像功能。使用
Uno 和 Spark
Cyto 兩者一同，實現了簡單的單一細胞孤立和單克隆細胞生長的確定，適用於各種下游應用。
圖1：使用Uno單細胞分配器和Spark Cyto的細胞系統發展工作流程。使用Uno單細胞分配器將單個HeLa細胞分離到96孔板中。在分配後1小時，通過螢光成像（CellTox™ Green Dye）確定細胞活力，並使用Spark Cyto的濃縮遮罩在分配後10天分析細胞生長。
材料和方法：
哺乳動物細胞培養：HeLa細胞（DSMZ，ACC 57）在DMEM培養基（DMEM，Gibco，#41966-029）中培養，補充有10％的胎牛血清（FBS，Gibco，#10270-098）、100
IU/ml青黴素和100 μg/ml鏈黴素（Sigma-Aldrich，# P0781），在37°C和5% CO2的細胞培養箱中培養。
單一細胞分離：使用Uno單一細胞分配器和C1a
Uno Dispensehead Cassette™（#30230841）芬提單個HeLa細胞。使用UnoControl軟體創建一個分配流程，使用與中等細胞大小（15-17
μm）相對應的流體類別，並將此流體應用於96孔板，以每孔分配一個細胞（圖2）。
圖2：UnoControl軟體用戶界面。左圖：選擇中等細胞流體類別（15-17 μm）以分離HeLa細胞。右圖：將HeLa細胞流體應用於96孔盤。
將約100個細胞/μl的細胞懸浮液重新懸浮在不含Mg2+和Ca2+的PBS中（Gibco，＃10010-015）。1將20μl的懸浮液加入C1a
Dispensehead Cassette，然後將細胞分配到80個含有200μl DMEM的孔中，DMEM中含有10％ FBS和抗生素。對於細胞活力評估，向40個孔的培養基添加CellTox™ Green
Dye（Promega，＃G8741），稀釋1:500。對於陰性對照，培養基中添加了CellTox
Green Dye（背景），對於陽性對照，播種了10,000個細胞，裂解並用CellTox
Green Dye染色（根據製造商的建議）。
細胞活力和單細胞生長分析：
使用Spark
Cyto 600多功能光學影像分析儀（Tecan）進行單個細胞株和細胞活力評估的分析。在成像過程中，環境條件針對細胞進行了優化，將溫度設定為37°C，二氧化碳濃度調整為5%。在單細胞分配後的1小時、1天和10天，以2倍物鏡在明視野和綠色螢光成像模式下拍攝圖像。單細胞的活力是在細胞分配後的1小時進行評估的。將明視野和綠色螢光成像通道的圖像疊加使得能夠檢測螢光的死細胞。通過使用Spark
Cyto的充實算法分析第10天的圖像，觀察細胞的生長。單細胞生長率是通過計算包含單一細胞株的孔數除以分配了單一細胞的總孔數來確定的。
結果：
使用Uno進行的單細胞分離在96孔盤的80盤中實現了97％的分離成功率（圖3），總運行時間為2分48秒。在細胞分離後，使用Spark
Cyto對孔進行了成像。使用2倍物鏡在單一視野中獲取整個孔的圖像。這使得在明場和螢光模式下快速高效地預覽樣品孔，優化焦平面和成像參數。分配後1小時的細胞活力為90％（40個孔中有4個孔包含死細胞）（圖4）。
圖3：Uno實現的97％細胞分離成功率（第0天）。
圖4：基於螢光成像的注射後一小時的90％細胞存活率。
在單細胞分離後的第1天和第10天掃描盤，以監測時間內的細胞群生長（圖5）。圖像使用Image
Analyzer™中的confluence算法進行分析，以根據面積覆蓋率和表現外觀來識別表現最佳的細胞群。總體而言，確定了47％的細胞生長率。
圖5：使用整個孔域成像進行細胞群檢測。 Spark Cyto用於在96孔板中獲取整個明視野圖像，該圖像會自動使用Image Analyzer軟件進行分析，以識別細胞生長區域（黃色遮罩）。
結論：
這裡描述的方法可以輕鬆適應各種研究和藥物開發應用，有助於推動新療法的發展以及我們對細胞過程的理解。本技術筆記突顯了Uno
Single Cell Dispenser和Spark
Cyto之間的協同作用，展示了它們在分離細胞、確保單株細胞性並對單個哺乳動物細胞群進行特性描述方面的優勢，用於細胞系的發展。
REFERENCES.
1) Andre Gross et al. Technologies for Single-Cell
Isolation. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16(8), 16897-16919.
2) Elizabeth M. Llufrio et al. Sorting cells alters their
redox state and cellular metabolome. Redox
Biology, 2018, 16, 381-387.
3) Culture preparation for dispensing mammalian
cells, Tecan Protocol。
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