光徑校正的原理

光徑校正

測定核酸濃度最常用的方法之一是基於測量樣品在260nm處的光學密度（OD260）。根據比爾定律，吸收的光量與樣品濃度成正比，也與光線穿過樣品時的光路長度成正比。例如，在260nm處的OD值為1.0對應於50微克/毫升的雙股DNA濃度。

大家熟知的~ DNA與RNA的絕對定量公式:
dsDNA conc.=A260x稀釋倍率x50ng/ul

ssRNA conc.=A260x稀釋倍率x40ng/ul
這是當樣品放在1公分cuvette測,光徑(光走的路徑)等於1公分時。

還記得…上面公式是怎麼來的嗎?
以Beer’s Law來說,
樣品濃度 = 吸光值 / 光徑 / 消光係數

DNA濃度 (µg / ml) = A260 / 1 / 0.02 = A260 x 50   DNA消光係數=0.02

DNA濃度 (µg / ml) = A260 / 1 / 0.025 = A260 x 40  RNA消光係數=0.025 

但微量盤的光徑是1公分嗎?
以微量盤來測DNA,RNA,光徑等於液體高度,並非cuvette的光徑1公分。那該如何知道well光徑呢? 雖然可以以液體體積、well底的形狀和well的直徑去作數學計算得知液體高度,但這個結果因為welll底呈現圓錐狀、分注液體的誤差及液體的在well中的變曲表面影響(Meniscus effects)。

Tecan的軟體i-control只要勾選光徑校正,每一筆得到的Excel檔data都會顯示該well光徑(液體高度) ,單位為公分,且顯示到小數點後四位哦!

它是利用水在977nm時有最高吸收值,在900nm時有最低吸收值的特性，來作光徑校正。 光徑校正的意義在於將樣品在微量盤中時測得的吸光值,透過光徑計算,得到當樣品在石英管時的吸光值,也就是校正後的吸光值。
樣品濃度 = 吸光值 / well光徑 / 消光係數

樣品濃度 = 校正後的吸光值 / 消光係數

以Beer’s Law來說,
樣品濃度 = 吸光值 / 光徑 / 消光係數

當樣品是水時，濃度與消光係數不變，光徑和吸收值成正比
所以

當水於cuvette(光徑= 1公分),測977nm與900nm時的吸收值的差為0.186，定義為correction factor (CF)

所以
well光徑(公分) = (A977_well - A900_well) / 0.186

有了正確的光徑後,我們就可以測得該樣品的吸收值,透過該樣品的消光係數，計算得到樣品濃度!

若使用軟體Magellan可作計算,讓您快速一次測96個樣品的DNA或RNA濃度及利用其與A230與A280比例來判斷核酸品質哦!

Katy Yang