使用R-BREAST 3D平台進行體外共培養和免疫腫瘤學分析的人乳腺癌

Tecan 應用文章 : 使用Spark® Cyto進行3D癌症模型的多重應用

Introduction

　　腫瘤細胞、細胞外基質（ECM）、基質細胞、免疫細胞和分泌因子之間的相互作用創建了一個保護性微環境，可能影響治療的有效性。因此，共培養系統，即在受控環境中培養不同細胞類型，已經成為乳腺癌研究中不可或缺的工具。這些系統使科學家能夠模擬癌細胞和腫瘤微環境中的其他細胞之間的相互作用，如免疫細胞和成纖維細胞，這些細胞在疾病的發展和進展中起著關鍵作用。研究乳腺癌細胞與其他細胞類型的共培養允許研究人員更好地了解推動疾病的分子機制，並識別潛在的治療靶點。免疫腫瘤學專注於利用免疫系統對抗癌症的能力，也是乳腺癌研究中迅速發展的領域。研究免疫細胞與癌細胞在共培養系統中的相互作用使研究人員能夠開發針對參與癌細胞免疫逃避的特定分子或途徑的新的免疫療法。

　　共培養系統和免疫腫瘤學方法最終有潛力為乳腺癌患者提供更有效和個性化的治療。然而，傳統的在培養基表面以平層方式培養細胞的方法可能無法準確反映癌細胞對治療的反應，因為這些模型缺乏復雜的腫瘤微環境。3D細胞培養提供的生理組織組織有潛力提供更可靠的臨床結果預測。

　　Predictive Oncology是一家以科學為基礎的公司，提供在藥物發現過程的早期引入人類多樣性的解決方案。該公司已經開發了一個3D培養模型，名為r-Breast，用於複製乳腺組織中的條件並重新創建腫瘤微環境，包括上皮細胞和基質細胞位。這提供了一種生理學相關的方法，用於評估新藥物或藥物組合，同時考慮到在細胞外基質組成方面的物種特定差異。

　　3D技術相對於2D細胞培養而言，需要更多的時間和金錢，因此進行多重分析是有益的，可以在一個實驗中獲得更多信息。本應用筆記描述了使用乳腺成纖維細胞和T細胞進行的兩種不同共培養系統的研究。首先，將乳腺成纖維細胞與乳腺癌細胞一同共培養，以評估對藥物敏感性的影響。其次，研究了程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）藥物對T細胞存在下的乳腺癌細胞存活率的影響。使用基於碘化丙啶的r-Breast模型和CellTiter-Glo®荧光分析（Promega）評估細胞存活率，並使用Spark Cyto多模式閱讀器高效地評估結果。

MATERIALS AND METHODS

Materials

• Spark Cyto multimode reader (Tecan)

• CellTiter-Glo 2.0 Cell Viability Assay (Promega)

• Propidium iodide (Thermo Fisher Scientific)

• r-Breast 3D breast cancer culture model

(Predictive Oncology)

• MDA-MB-231 human breast cancer cell line (ATCC)

• T-47D human breast cancer cell line (ATCC)

• Pembrolizumab (Thermo Fisher Scientific)

• Paclitaxel (Adipogen)

• Cisplatin (EMD Millipore)

• Human cancer-associated fibroblasts (BioIVT)

• Hoechst (Thermo Fisher Scientific)

• Propidium Idodide (Thermo Fisher Scientific)

• PBMC (ATCC)

 

r-Breast co-culture set-up

　　培養皿首先塗覆一種特別設計的基質，模擬乳腺組織的基質成分。然後，乳腺癌細胞株與r-Breast基質結合，層狀放置在培養皿的基質上。混合物凝固形成一個厚度約為800至1,000微米的3D層。隨後，引入富含與腫瘤發展相關的特定因子的生長培養基到培養中。為了進一步模擬複雜的腫瘤環境，基質細胞或與癌症相關的成纖維細胞（CAFs）可以包括在3D層中，以建立上皮細胞和基質細胞之間的共培養系統。經過3至5天的培養，乳腺癌細胞會自組織成複雜的組織結構，密切模擬其體內行為。一些細胞株會生成球狀體，而其他細胞則形成星狀或互聯結構。

　　一旦建立了3D培養，各種治療劑，如小分子、抗體、抗體藥物共軛物、雙/三特異性劑和CAR-T細胞等，可以應用於細胞上。然後可以在培養中直接評估對這些治療的反應，使用顯微鏡、CellTiter-Glo分析和免疫組織化學等技術。此外，細胞或球狀體可以通過非酶消化與r-Breast基質分離，用於後續應用，如流式細胞術、下一代测序或移植到動物模型中。

 圖1：r-Breast 3D共培養設置包括一個簡單的四個步驟。1）將基質基質塗覆在培養皿上。2）將細胞與r-Breast基質混合，然後覆蓋基質基質。3）聚合。4）添加具有疾病特定補充劑的生長培養基。

 

Propidium iodide positive cell imaging in r-Breast 3D cultures

在r-Breast 3D培養中的碘化丙啶陽性細胞影像

　　Predictive Oncology的3D培養平台的一個顯著優勢是能夠長時間維持細胞培養。這使研究人員能夠檢查具有不同作用速度的藥物的效應，包括快速和緩慢作用的治療劑。碘化丙啶（PI）活性試驗是一種可靠的方法，用於隨著時間的推移評估複雜培養結構中的細胞存活，以及調查由抗癌治療引起的細胞存活率的變化。

　　在這項研究中，探討了PD-1抑制劑帕博利珠單抗對兩種乳腺癌細胞株（MDA-MB-231，三陰性和T-47D，雌激素受體陽性/黃體激素受體陽性，ER+PR+）與T細胞的存活率的影響。T細胞事先與帕博利珠單抗結合，然後與乳腺癌細胞株在96孔培養皿中進行共培養。乳腺癌細胞和T細胞以兩種不同的比例種植（BCa:T 3:0和BCa:T 3:1），然後將帕博利珠單抗以不同濃度加入培養基。在培養8天後，將細胞染色為Hoechst（發射波長461納米）和PI染料，並使用以下方案評估其存活率：

1. 在不干擾ECM基質的情況下移除培養基。

2. 向每個孔中添加100 μ升的PI染色溶液（濃度為10 μg/ml）。

3. 在室溫下，避光情況下孵育30分鐘。

4. 吸取每個孔中的PI溶液，並用PBS洗滌細胞兩次，以去除未結合的染料。

5. 向每個孔中添加100 μ升新鮮培養基。

6. 使用Spark Cyto在染色後1小時內拍攝細胞，使用綠色（用於GFP標記）和紅色光學濾鏡組。對於3D培養，將焦點偏移設置為300-400 μm，曝光時間為10-50毫秒，使用10倍物鏡。

7. 使用ImageJ軟件分析所獲得的圖像，並量化PI染色和未染色細胞的比例。

CellTiter-Glo analysis

CellTiter-Glo試驗是一種廣泛應用的方法，用於評估細胞增殖，建立生長曲線，並測量某些治療劑的細胞毒性或抗增殖效應。在這項研究中，它被用來展示化療藥物的效力。MDA-MB-231和T-47D乳腺癌細胞株在r-Breast 3D基質中與或不與乳腺成纖維細胞一同培養3天，然後分別使用各種濃度的紫杉醇或順鉑進一步培養7天。

Assay protocol (96-well plates):

1. 在室溫下將微板靜置約30分鐘。

2. 從每個孔中移除140 μl的培養基，不干擾基質，使每個孔中留下約60 μl的培養基（假設每孔的總開始體積為200 μl）。

3. 按照生產商的方案，向每孔中添加100 μl的CellTiter-Glo 3D試劑。

4. 通過反復吸入和吸出來強烈混合內容以溶解細胞。

5. 在室溫下孵育微孔盤25分鐘以穩定信號。

6. 使用積分時間為100毫秒並應用OD=1中性密度濾光片讀取Spark Cyto讀取器上的發光信號，以減弱高強度光。

 

RESULTS AND DISCUSSION

PI imaging and analysis

在活化T細胞存在的情況下，使用PD-1抑制劑pembrolizumab調解的T47D-GFP和MDA-MB-231-GFP細胞存活率的評估，提供了T細胞誘導的癌細胞死亡的令人信服的證據。使用PI的存活率染色顯示，隨著PD-1抑制劑的劑量增加，死亡細胞的比例增加，即在圖2中紅色點的數量增加。這些觀察結果證明了PD-1阻塞在促進T細胞調解的癌細胞清除方面的有效性，凸顯其作為癌症免疫治療的治療策略的潛力。

圖2：(A) T47D-GFP和(B) MDA-MB-231-GFP細胞株與預先活化的T細胞共培養的存活率染色。

 

使用ImageJ分析軟件來確定PI染色和未染色細胞的比例，並使用GraphPad軟件繪製pembrolizumab 對細胞存活率的影響（圖3），顯示在PD-1藥物存在的情況下死亡細胞數量增加了一倍。

圖3：乳腺癌細胞株與T細胞共培養，並受不同濃度的帕博利珠單抗治療，PI陽性（死細胞）分析。

CellTiter-Glo analysis

兩種細胞株對紫杉醇的敏感性高於對順鉑的治療（圖4）。在r-Breast平台中與乳腺成纖維細胞一同培養的細胞比起在沒有乳腺成纖維細胞的情況下培養的細胞，對兩種化合物的治療表現出更高的抵抗力。這可能是因為r-Breast 3D模型與乳腺成纖維細胞共培養，更好地模擬了腫瘤微環境，為腫瘤細胞提供了一定程度的保護。

圖4：（A）T-47D和（B）MDA-MB-231人類乳腺癌細胞株在與或沒有乳腺成纖維細胞共培養的情況下對紫杉醇和順鉑的反應。使用CellTiter-Glo發光試驗和Spark Cyto讀取器測量治療反應。

 

Conclusion

　　本研究中呈現的結果凸顯了使用r-Breast平台來研究與其他細胞類型一同處於化療藥物暴露下的乳腺癌細胞的重要性。該培養結構依賴於細胞特性，形成各種不同的結構，從球體到星狀結構和細胞網絡不等。這項研究的發現將有助於理解帕博利珠單抗在乳腺癌治療中的作用，並表明在r-Breast平台上與乳腺成纖維細胞一同培養的細胞對治療具有更高的抵抗力。這些發現可能對新型腫瘤學藥物和免疫療法的開發產生影響。

　　Spark Cyto多功能判讀儀實現了多重分析，通過PI染色來檢驗細胞存活率，然後進行CellTiter-Glo發光試驗。Spark Cyto的多功能性使其非常適合執行這種多重協議，通過在一個實驗中檢查複雜的功能性試驗中的細胞反應，降低成本並節省時間。

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