BCA, Modified Lowry and Bradford assays – Protein quantification 蛋白質定量

 以吸收光測試蛋白質定量

Figure 1: Bradford Protein Assay measured in cuvettes, showing increasing protein

concentrations.

ASSAY OVERVIEW

Technology

Absorbance吸收光

原理

這三種試驗都是為了測定樣本的蛋白質濃度而設計的。為了進行檢測，需要向樣本中添加液體試劑。這個試劑與蛋白質互動，導致可見的顏色變化（圖1），這個變化與濃度成正比。絕對濃度是使用標準曲線來計算的。

機制

　　BCA™蛋白質試劑（Thermo Scientific Pierce）使用雙氰對苯二甲酸（BCA）來對樣本中的總蛋白質進行比色定量。該方法基於蛋白質在鹼性介質中將Cu2+還原為Cu+，形成有色的水溶螯合物，可以在其吸收極大值562 nm處測量。對BSA的線性工作範圍為20至2000 μg/ml。

　　Bradford蛋白質試劑（BioRad）基於CoomassieR Brilliant BlueG-250染料，該染料與鹼性和芳香族氨基酸殘基，特別是精氨酸，結合。這導致染料的吸收極大值從465 nm變為595 nm。Bradford試劑可以作為微量試驗程序進行，線性範圍為125至1000 μg/ml BSA。

　　在Modified Lowry蛋白質試驗（Thermo Scientific Pierce）中，蛋白質與鹼性溶液中的硫酸銅和酒石酸反應，形成四配位的銅-蛋白質復合物，還原Folin-Ciocalteu試劑。這個藍色的水溶產物的吸光度可以在750 nm處測量。該試劑——使用BSA蛋白質16進行測試——在1至1500 μg/ml的範圍內表現出良好的線性特性。

 

替代方案

用於蛋白質定量的潛在替代方案包括基於吸光度的方法，使用蛋白質消光係數，或者使用像NanoOrange®等基於螢光的試劑，甚至使用專用設備。