引言
微量盤分析儀在特定測量模式下的敏感度或偵測極限（DL），取決於多種不同因素。日常儀器操作和儀器設置對敏感度確定的結果具有決定性的影響。對於冷光應用，以下為關鍵準則：
1.
在執行第一次測量之前，應至少提前20分鐘打開微量盤分析儀。這是必要的，因為Infinite
200 PRO系列的高靈敏度光子計數管（Photon Counting Tube,
PCT）需要在其規範內平衡才能正常工作。
2.
在執行需要超過5分鐘的測量（如冷光動力學或長積分時間的讀數）時，需打開儀器的溫度控制。由於大多數螢光素酶的活性與溫度有高度依賴性，因此該步驟非常重要。
3.
由於儀器在操作過程中會升溫，這會隨時間對微量盤上的冷光訊號的一致性造成影響。維持設定溫度（RT+4°C）可使儀器穩定，以避免漂移的冷光訊號。
4.
對於每種冷光應用，使用者應最佳化積分時間（即訊號收集持續時間）。作為經驗法則，flash
luminescence-based的應用需要1至20秒的積分時間，而glow luminescence-based的應用需要100毫秒至1秒的積分時間。
5.
對於尚未建立的冷光應用，應使用“Automatic Attenuation”功能。此功能將增強Infinite 200 PRO的動態範圍，而不會損失靈敏度，並避免在輸出中出現不必要的“OVER”值。
6.
在大多數情況下，150毫秒的穩定時間足以避免孔內液體的不必要攪動，這可能會對讀數的精度產生負面影響。
7.
除了優化儀器設置外，某些參數設定對於測量的成功也很重要。使用適合盤型、微量盤型式和填充體積是最大化讀數性能的必要條件。
8.
對於所有冷光測量，使用白色微量盤以增強發光信號是非常重要的。然而，白色微量盤也可能是誤差的來源，因為它們在實驗室一般可見光下會“裝滿”光子。儀器會檢測到這種自磷光，導致背景信號的一致性不佳。在昏暗的光線下工作，並在開始測量前在儀器內將微量盤靜置最多10分鐘，將最小化這種偽現象，降低空白孔的標準偏差，提高檢測限（見方程1和2）。
9.
需要進行科學正確的數據處理以獲得穩健的結果。通過使用Grubbs'異常值檢驗（1）來刪除由於移液和/或板錯誤而導致的不需要的異常值，這對於包含測定空白的那些孔尤其重要。
10. 本技術說明描述了用於確定基於濾鏡式微量盤分析儀Infinite
F200 PRO和基於Infinite
M200 PRO Quad4 Monochromators™全波長式微量盤分析儀的最大儀器敏感度的優化測試設置、儀器設置和統計方程式，用於閃光和持續發光測量。
GLOW
LUMINESCENCE
材料與方法
儀器
Infinite M200 PRO Quad4 Monochromators™ 全波長式多功能分析儀
Infinite F200 PRO 濾鏡式多功能分析儀
微量盤
384孔，白色聚苯乙烯（Greiner®,
德國）
試劑
144-041 ATP檢測試劑盒SL（BioThema, 瑞典）
ATP-Free Water
移液程序：
根據Table
1中的微量盤配置，每個孔以25
ul體積填充，並加滿整個384孔盤。取5 ul的ATP配製溶液（1 nM，10 nM，100
nM，1 uM ，10 uM）或空白（水）移液到對應的孔中，並於每個孔加入20
ul的反應混合液。為了去除氣泡，可以500-2000 rpm速度快速Spun down，(Heraeus Labofuge 400e）。實驗過程為避光。
測量參數和儀器設置
使用Table 2中的儀器設置，對該盤進行了三次冷光測量。由於Infinite
F200 PRO和Infinite
M200 PRO的冷光模組相同，因此在儀器設置的最佳化方面沒有差異。
在三次測量中執行第一次測量之前，將微量盤在儀器內靜置5分鐘，以減少來自白色盤的冷光背景干擾（微量盤自磷光）。
格魯布斯檢驗：
進行了格魯布斯異常值檢驗，以移除空白孔（裝有水的孔）中的明顯異常值。格魯布斯檢驗（又稱最大歸一化殘差檢驗）是一種統計檢驗，用於檢測假設來自常態分佈母體的單變數數據集中的異常值（2）。該檢驗使用GraphPad的線上計算器進行，顯著性水準設為0.05（3）。
偵測極限（DL）：
在移除空白異常值後，使用20
nM ATP樣本的訊號計算了偵測極限。
格魯布斯檢驗和偵測極限的計算是針對每個單獨的測量進行的。計算三個偵測極限的平均值並用於確定儀器的靈敏度。由此產生的絕對靈敏度以pM為單位轉換為每孔的相對靈敏度（amol/well）。
備註：本備註中呈現的數據代表了典型的性能值，而不是儀器規格。
FLASH LUMINESCENCE
材料與方法
儀器
Infinite M200 PRO Quad4 Monochromators™ 全波長式多功能分析儀
Infinite F200 PRO 濾鏡式多功能分析儀
微量盤
384孔，小體積，白色聚苯乙烯（Greiner®,
德國）
試劑
ENLITEN® ATP 測定系統（Promega）
ATP-Free Water
移液程序：
根據Table 4中的微量盤配置，以每孔55 ul體積，並加滿整個384孔白色盤。將5 ul 的ATP配製溶液（1 nM，10 nM，100
nM）或空白（水）的移液到相應的孔中，然後使用Infinite
200 PRO 的 注入系統(Injector
system)，向每孔中加入50 ul的ENLITEN反應試劑。
備註：在開始注給ENLITEN反應試劑之前，應使用ATP-Free Water清洗注入系統（≥ 20次活塞推動）。
測量參數和儀器設置
使用Table 5中的儀器設置，對該盤進行了三次冷光測量。由於Infinite
F200 PRO和Infinite
M200 PRO的冷光模組相同，因此在儀器設置的優化方面沒有差異。在開始測量之前，將微量盤在儀器內靜置5分鐘，以減少來自白色盤的冷光背景值（微量盤自磷光）。
數據處理
依照glow luminescence
實驗使用的方法，對每個單獨測量進行格魯布斯檢驗和偵測極限的計算。計算了三個偵測極限的平均值，用於確定儀器的靈敏度。由此產生的絕對敏感度以fM為單位轉換為每孔的相對靈敏度（amol/well）。
備註：本備註中呈現的數據代表了典型的性能值，而不是儀器規格。
結論
結果清楚展示了Infinite
200 PRO系列在glow luminescence和flash luminescence方面的卓越性能。按照上述的靈敏度測試和儀器設置，可以幫助提高檢測極限，最大化儀器的靈敏度。
本文討論的原則適用於所有基於冷光的應用；然而，系統最終的最佳設置將根據分析方式和用戶的需求而有所不同。
文獻
[1] Frank E. Grubbs. (1969). Procedures for Detecting
Outlying Observations in Samples. Technometrics Vol. 11 (1), 1-21.
[2] http://en.wikipedia.org/wiki/Grubbs%27_test_for_outliers
[3] http://www.graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm
Henry Wei
